掃描電鏡(SEM)作為現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要工具，能夠高分辨率地展示細(xì)胞、組織等生物樣品的表面形貌和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。

　　一、生物樣品掃描電鏡具體步驟

　　樣品準(zhǔn)備

　　取材：根據(jù)研究目的準(zhǔn)確取材，確保樣品具有代表性且體積不宜過(guò)大，一般不超過(guò)8mm×8mm，厚度不超過(guò)5mm。對(duì)于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，需固定在濾紙或卡片紙上以充分暴露待觀察的表面。

　　固定：樣品需進(jìn)行雙固定處理，先用1%-3%的戊二醛/緩沖液在室溫或4°C下前固定，時(shí)間根據(jù)樣品特性而定。隨后用1%餓酸/緩沖液在4°C下進(jìn)一步固定。固定過(guò)程旨在保持樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

　　清洗：對(duì)于表面凹凸不平或有雜質(zhì)的樣品，在固定前后需進(jìn)行清洗，以去除雜質(zhì)，避免影響成像質(zhì)量。

　　脫水與置換

　　逐級(jí)脫水：樣品需經(jīng)系列濃度的乙醇或丙酮逐級(jí)脫水，一般從30%、50%、70%、80%、95%至100%，每步處理10-15分鐘。

　　置換：用乙酸異戊酯置換100%乙醇，室溫下放置20分鐘以上，以減少樣品在干燥過(guò)程中的收縮和變形。

　　干燥

　　干燥方法多樣，包括臨界點(diǎn)干燥、空氣干燥、化學(xué)藥品干燥和冷凍干燥等。干燥過(guò)程需確保樣品表面形貌不被破壞，且樣品需干燥無(wú)水、無(wú)易揮發(fā)溶劑，以避免對(duì)電鏡造成損傷。

　　導(dǎo)電處理

　　噴涂導(dǎo)電膜：在真空條件下，對(duì)樣品表面噴涂10-20nm厚的金或鋁膜，以增強(qiáng)樣品的導(dǎo)電性，確保電子束能順利釋放二次電子，從而改善圖像的亮度和反差。

　　上鏡觀察

　　將處理好的樣品放置在掃描電鏡的樣品臺(tái)上，調(diào)整樣品高度至距電子槍既定距離(一般約10mm)。

　　啟動(dòng)掃描電鏡，設(shè)置加速電壓、放大倍數(shù)、掃描速度等參數(shù)，通過(guò)控制器和電腦對(duì)樣品進(jìn)行觀察，獲取樣品的形貌和結(jié)構(gòu)信息。

　　二、檢定過(guò)程中需要注意的事項(xiàng)

　　樣品準(zhǔn)備質(zhì)量

　　確保樣品制備過(guò)程中的每一步都精細(xì)操作，避免對(duì)樣品造成機(jī)械損傷或化學(xué)污染。

　　固定、清洗、脫水和干燥等步驟需嚴(yán)格控制時(shí)間和條件，以保證樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)不被破壞。

　　電鏡操作環(huán)境

　　保持操作環(huán)境清潔無(wú)塵、無(wú)震動(dòng)、無(wú)電磁干擾，以保證掃描電鏡的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

　　定期清潔和維護(hù)電鏡設(shè)備，確保其長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。

　　參數(shù)設(shè)置與校準(zhǔn)

　　根據(jù)樣品的特性和觀察需求合理設(shè)置掃描電鏡的參數(shù)，如加速電壓、放大倍數(shù)等，以獲得最佳的圖像質(zhì)量和分辨率。

　　在觀察前進(jìn)行必要的校準(zhǔn)操作，如調(diào)整電子束的掃描速度和掃描模式等，以確保圖像的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

　　樣品導(dǎo)電性

　　對(duì)于非導(dǎo)電樣品，噴涂導(dǎo)電膜是一步。導(dǎo)電膜的厚度需適中，既能改善圖像質(zhì)量又不掩蓋樣品結(jié)構(gòu)。

　　對(duì)于某些無(wú)法噴鍍導(dǎo)電膜的樣品，可采用低真空模式觀察以緩解荷電效應(yīng)。

　　安全注意事項(xiàng)

　　在操作過(guò)程中佩戴干凈無(wú)粉手套，避免直接接觸樣品和設(shè)備以減少污染。

　　注意個(gè)人防護(hù)措施，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露在電子束輻射下。

　　遵守實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程，確保設(shè)備和人員的安全。

　　綜上所述，生物樣品掃描電鏡技術(shù)涉及多個(gè)精細(xì)步驟和注意事項(xiàng)。只有嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行樣品準(zhǔn)備和檢定過(guò)程，才能獲得高質(zhì)量的觀察結(jié)果并確保電鏡設(shè)備的長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展，掃描電鏡將在生命科學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。