TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測技術是一種靈敏且廣泛應用的方法，用于檢測細胞凋亡過程中DNA斷裂產生的3'-OH末端。本文將詳細介紹TUNEL細胞凋亡檢測的具體步驟以及在檢定過程中需要注意的事項。

　　一、TUNEL細胞凋亡檢測具體步驟

　　以下步驟基于不同來源的參考信息綜合整理，具體步驟可能因試劑盒品牌或實驗條件的不同而有所差異：

　　樣本準備

　　組織樣本：將組織樣本進行脫蠟和水化處理，通常包括在二甲苯中浸泡，然后用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)逐步脫水。

　　細胞樣本：對于貼壁細胞，先用PBS清洗，然后用4%多聚甲醛固定一定時間(如1小時)，再進行細胞通透處理(如使用Triton X-100)。

　　細胞通透

　　使用蛋白酶K(Proteinase K)處理樣本，通透細胞膜和核膜，確保TUNEL探針能夠進入細胞內。處理時間通常為15-30分鐘，具體取決于樣本類型和厚度。

　　TUNEL反應混合液制備

　　根據試劑盒說明書，制備TUNEL反應混合液。處理組通常包括TdT酶和熒光素標記的dUTP，而陰性對照組則不含TdT酶。

　　TUNEL反應

　　將TUNEL反應混合液滴加到樣本上，覆蓋蓋玻片或封口膜，在暗濕盒中避光孵育一定時間(如37℃下60分鐘)。

　　清洗與觀察

　　使用PBS充分清洗樣本，去除未結合的探針。

　　在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，通常使用特定的激發波長(如450-500nm)和檢測波長(如515-565nm)。

　　（可選）酶聯顯色反應

　　對于某些試劑盒，還可以將熒光信號轉化為比色信號，以便在光學顯微鏡下觀察。這通常涉及使用POD轉換液和DAB底物進行顯色反應。

　　復染與封片

　　使用蘇木素或甲基綠對樣本進行復染，以襯托組織形態結構。

　　脫水、透明、封片后，在光學顯微鏡下觀察并拍照記錄結果。

　　二、檢定過程中需要注意的事項

　　樣本處理

　　確保樣本脫蠟和水化充分，避免影響后續步驟的結合反應。

　　細胞通透時間要適中，過長可能導致細胞破損，過短則可能影響探針進入細胞。

　　試劑配制與使用

　　TUNEL反應混合液應在使用前新鮮配制，避免長時間保存導致酶活性降低。

　　注意TdT酶對溫度的敏感性，儲存和使用時應避免反復凍融。

　　實驗條件控制

　　孵育溫度和時間應嚴格按照試劑盒說明書進行，避免影響反應效率。

　　實驗過程中應避光操作，以保護熒光探針不受光淬滅。

　　清洗步驟

　　PBS清洗步驟應充分，避免非特異性染色影響實驗結果。

　　清洗次數和時間可根據實際情況進行調整。

　　對照設置

　　必須設置陽性對照和陰性對照以驗證實驗結果的可靠性。陽性對照通常使用DNase I處理樣本以誘導DNA斷裂;陰性對照則不加TdT酶。

　　結果分析

　　觀察結果時應注意區分凋亡細胞與正常細胞以及非特異性染色。

　　可結合復染結果和顯微鏡下的形態學特征進行綜合分析。

　　TUNEL細胞凋亡檢測服務涉及多個精細步驟和注意事項。遵循正確的操作步驟和注意檢定過程中的細節問題對于獲得準確可靠的實驗結果至關重要。