免疫組化非特異性染色的八大原因

     免疫組織化學技術（immunohistochemistry），是一項利用抗原抗體反應，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。

    然而，結果卻未必都是那么如意的，常常出現下面這種狀況，好好的一張片子染得臟臟的，這就是常見的非特異性染色。

     1. 抗體問題

     一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色，建議用高純度，價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具，所以要注意抗體的有效期。

     2. 抗體濃度過高/孵育時間過長

     一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使用新抗體前應該多做預實驗，摸索出適合的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后，立刻調好定時器，提醒自己及時終止反應，就會避免這個問題。

     3. DAB染色時間太長/變質

     DAB的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。DAB要保存于避光干燥的地方，現用現配，臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果棒棒噠!

     4. 內源性酶和生物素

     內源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶：常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分內源性堿性磷酸酶；對于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；對于內源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對于內源性生物素，染色前將切片浸于25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。

     5. 組織變干

     一下子染太多片子的時候，容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈，把試劑圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣3-4 mm。

     6. 浸泡時間過長

     切片在緩沖液或修復液里面浸泡過夜，也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。毛博的獨門秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里，過夜*沒有問題。

     7. 清洗不充分

     清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測PH值。緩沖液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。

     8. 封閉血清問題

     是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘。這里不用洗，直接甩掉即可。